ترجمه مقاله تحلیل مکانیزم آلودن غشا برای فرآیند الترافیلتراسیون پروتئین کشک

4. تحلیل مکانیزم آلودن غشا برای فرآیند الترافیلتراسیون پروتئین کشک

فرآیندهای غشای مبتنی بر فشار، شامل اسمز معکوس (RO)، نانوفیلتراسیون (NF)، الترافیلتراسیون (UF) و میکروفیلتراسیون (MF) برای جداسازی باکتری از کشک، تغلیض و کانی زدایی کشک، تفکیک پروتئین های کشک، بازیابی پروتئین ها از آب های حاصل از فرآیند صنعت لبنیات و اهداف دیگر استفاده شده اند. علاوه بر UF کم فشار، NF مبتنی بر فشار نسبتاً زیاد و RO به عنوان ابزاری برای بازیابی پروتئین ها در فرآوری کشک، گزارش داده شده اند، جایی که تزریق بیشتر مواد محلول کوچک و نمک ها ممکن است حاصل شده باشد. اما، انرژی پمپاژ زیاد و ویسکوزیته یا گرانروی زیاد لیکوئرها یا عصاره ها، ضریب غلظت حداکثر قابل حصول را محدود می کنند. علاوه بر آن، آلوده شدن برگشت ناپذیر تحت فشار هوای زیاد معمولاً باعث می شود بازیابی شار غشا علیرغم تمیزکاری، دشوارشود. بخصوص با MF و UF آلودن درازمدت هر دوی کشک شیرین واسیدی و کاهش مداوم انتقال، زمان عمر تجهیزات فیلتراسیون را محدود می کند. تاکنون، هیچ بررسی در مورد دلایل علتی و مکانیزمی فرآیند آلودگی در طی MF و UF، وجود نداشته است (استینهاوئر، مارکس، بوگندورفر و کولوزیک، 2015). رفتار شار و نگهداری مشاهده شده در الترافیلتراسیون ممکن است به مکانیزم های آلودگی بسیاری (یعنی برهمکنش های آبگریز، برهمکنش های الکترواستاتیکی) و خواص پروتئین (یعنی رفتار تجمع، اندازه)، ارتباط داشته باشند.

 

1.4. اثر pH، دما، قدرت یونی و TMP بر آلودن غشا

با این حال، عیب اصلی فرآیندهای الترافیلتراسیون، آلودگی غشا است که به تدریج شار گذردهی را کاهش می دهد و مقاومت هیدرولیک را افزایش می دهد و بنابراین، بهره وری کلی فرآیند را از بین می برد. در مورد صنعت لبنیات، پروتئین ها، ترکیبات اصلی مسئول آلودگی غشا می باشند. این پدیده بخاطر نیروهای اثر متقابل پروتئین-پروتئین و پروتئین-غشا می باشند و به عوامل مختلف مانند pH، دما، ترکیب محلول تغذیه شده، مشخصات غشا (یعنی اندازه تخلخل و مواد) و شرایط عملکردی (یعنی فشار تراغشا و سرعت جریان مقطعی)، می باشد. بخاطر تاثیر زیادی که کاهش شار گذردهی بر بهره وری فرآیند دارد، پژوهش ها بر پیش بینی تغییرات زمانی شار گذردهی با توسعه مدل ریاضیاتی تمرکز کرده اند (کورباتون-باگوینا، آلوارز-بلانکو و وینسنت-ولا، 2018). pH، دما، قدرت یونی و فشار تراغشا  (TMP) نقش های مهمی در تاثیر گذاری بر خواص فیزیکی شیمیایی پروتئین مدل (یعنی آلبومین سرم گاوی) و انتقال آن از درون غشاهای الترافیلتراسیون، ایفا کردند. علاوه بر آن، ناوارو-لیسبوا و همکاران (2017) دریافتند که شارها در قدرت یونی کمتر، و در مقادیر pH بالاتر (یعنی pH=8)، بیشتر بوده اند.

اثر pH عملیاتی با اندازه گیری باقیمانده های شار و محصول گذردهی آلفا-لاکتالبومین، بتا-لاکتاگلوبولوین، BSA، IgG و لاکتوفرین، ارزیابی شد. در pH های برابر با 3، 9 و 10، شارهای گذردهی از 68 تا 85، 91 تا 87 و 89 تا 125 لیتر بر (متر مربع ساعت) به ترتیب، تغییر پیدا کردند. در اطراف نقاط ایزوالکتریک پروتئین های عمده (یعنی در pH برابر با 4 و 5)، شارهای نفوذپذیری از 40 تا 25 و از 51 تا 25 لیتر بر (متر مربع ساعت) تغییر یافتند. برای آلفا-لاکتالبومین و آلفا-لاکتوگلوبولین، حاصلجمع محصول های نگهداری و گذردهی در همه موارد تقریباً 100% بود که این نشان دهنده آن است که هیچگونه افت و هدر رفت این پروتئین ها رخ نداد. بعد از 4 دی آولوم (diavolume)، محصول نگهداری برای آلفا-لاکتالبومین از 43% در pH=9 تا 100% در pH=4 تغییر یافت درحالی که برای بتا-لاکتوگلوبولین، از 67% در pH 3 تا 100% در pH 4 تغییر یافتند. برعکس، BSA، IgG و لاکتوفرین عمدتآً حفظ شد و در نتیجه بهبود بالغ بر 60% از نظر خلوص در pH=4 با توجه به کشک اصلی، حاصل کرد ( ام سی آلمسیجا، آبیانیز، گوادیکس و گوادیکس، 2007).

مقادیر pH باید به مقادیر pI ناخالصی ها نزدیک باشد (pH=pI±1) و باید تا آنجا که ممکن است از pI پروتئین محصول دور باشد تا تفاضل حجم هیدرودینامیک موثر اجزاء به حداکثر برسد. بار غشاء باید هم علامت  با  بار پروتئین محصول در مقدار pH انتخاب شده باشد تا دافعه الکترواستاتیک محصول از تخلخل های غشا، بهبود یابد (وان ریس، بریک، چارکودیان، برنز، و زیدنی، 1999؛ وان، گادام، فروتچی، اورلاندو، گودریش، ساکسنا و همکاران، 2015). بخاطر اینکه پروتئین های عمده کشک، نقطه ایزوالکتریک میانگین (pI) برابر با 6/4 دارند، این پروتئین ها یک بار منفی خنثی در pH خنثی کشک دارند و باید به نحو الکترواستاتیک بوسیله غشای بار منفی با تخلخل های عریض، دفع شوند. بخاطر تخلخل های عریضتر و در نتیجه نفوذپذیری بیشتر، غشا باید کار کردن در شار بالاتر را اجازه دهد (آرونکومار و اتزل، 2015).

دما تاثیر غیرمستقیمی بر ساختار لایه رسوب دارد. ساختارهای لایه رسوب متراکم در صورتی بوجود می آیند که یا نیروهای دافعه کم باشند یا نیروهای واندروالس جاذبه ای بخاطر قرار گیری حرارتی هسته پروتئین آب دوست به محیط، افزایش یابد. در حالت افزایش آب گریزی پروتئین، جذب سطحی پروتئین به سطوح جامد، مانند غشاها، بهبود می یابد. تاثیر دما بر آلودگی غشا در طی هر دوی الترافیلتراسیون و ریزفلیتراسیون کشک و سوسپانسیون های پروتئین کشک مورد بررسی قرار گرفت. آلوده شدن غشا بخاطر فرآیندهای جذب در دماهای ≤10℃ و >35℃ در طی میکروفلیتراسیون (تراوش پروتئین کامل کشک)، تسهیل یافت. افزایش دما در طی فیلتراسیون کشک شیرین باعث افزایش سریع آلودگی غشا برای دماهای بالاتر از 40℃ شد. هنگام افزایش دما، واکنش آلودگی قوی تر در محدوده pH طبیعی را می توان به هر دوی شتاب سرعت واکنش تیول/دی سولفید و همچنین اتصال عرضی پروتئین برپایه کلسیم نسبت داد (استایهاور، هینلی، بوگندورفر و کولوزیک، 2015).

پدیده آلودگی نتیجه رسوب پروتئین است. پروتئین ها بوسیله اثر دما بر پیوندهای غیراکووالانسی دخیل در تثبیت ساختار ثانویه و ثالث، برای مثال، پیوند آبگریز، الکترواستاتیک و هیدروژنی، طبیعت زدایی (denature) می شوند. هنگامی که ساختارهای ثانویه و ثالث یک پروتئین، باز نشده نباشند، گروه های آبگریز برهمکنش می کنند و اتصال آب را کاهش می دهند. چنین برهمکنش های آبگریز باعث تجمع و پس از آن انعقاد و رسوب می شوند. طبیعت زدایی یا غیرطبیعی سازی، حلالیت پروتئین را در مقایسه با پروتئین بومی کاهش می دهد و باعث تجمع و دشواری بازگشت پذیری هنگام خنک شدن و در نتیجه گرفته شدن (آلودن) یا رسوب مکانیکی می شود و این نیز آلودن در نظر گرفته می شود (پلگرین و گاسپارتو، 2006). گرفتگی یا آلودگی منحنی های pH نیز در دماهای مختلف تغییر یافت (هگ، کاستبرگ، و لوند، 1985).

علاوه بر آن، قدرت یونی نیز نقش مهمی در برهمکنش بین مولکول های پروتئین برای آلوده شدن غشا ایفا می کند. یون های Na⁺، Cl^- و Ca²⁺ معمولاً در کشک وجود دارند. تفاوت عملکرد غشای UF در حضور Na⁺ و Ca²⁺ مشاهده شده است (ای، جی، فین، فل و سوکی، 1983). با افزایش قدرت یونی، نرخ گرفتگی غشا افزایش یافت، زیرا متراکم شدن لایه مضاعف الکتریکی (EDL) باعث دافعه الکترواستاتیک ضعیف می شود (شی، تانگ، وانگ و ژانگ، 2009). Ca²⁺، رسوب پروتئین برروی سطح غشا از طریق یک اثر پل سازی را ارتقاء داد. در عین حال، بنظر می رسد افزودن NaCl رسوب پروتئین های باینری برروی سطح غشا را با کاهش واکنش بین مولکولی، ارتقاء دهد. اما، Ca²⁺ توانست گرفتگی غشا بخاطر تشکیل لایه کیک سست با آزمایش های غشای PVDF UF، کاهش دهد (دینگ، ما، لیو و کیو، 2018). با افزایش قدرت یونی، رسوب پروتئین بوسیله اثر حفاظ گذاری بار بر واکنش های آلوده کننده-آلوده کننده و غشا-آلوده کننده، کاهش یافت (جی. لی، اس. جیونگ، ای. یه، وی. چن، اس. ویگنسواران، تی.او.لیکنس، و همکاران، 2017). علاوه بر آن، پروتئین تجمع، یک لایه کیک سست بر سطح غشا تولید کرد که این می تواند نرخ دفع پروتئین را کاهش دهد.

فیلتراسیون غشا در مقدار TMP پایین می تواند آلودگی و قطبیت غلظت را رفع کند اما شار کمتری دارد. TMP بالاتر می تواند  نیروی هدایت کننده را تقویت دهد و بنابراین، شار را بهبود بخشد و از آلودگی جلوگیری کند (اس. جیانگ، ژانگ، ژائو، یو، ژو و چو، 2018). مسئله تنش برشی بر ساختار پروتئین، همچنان مورد توجه است، زیرا یک پدیده معمول در فرآوری زیستی است. مولکول های پروتئین به هم کوپل و تزویج می شوند و توده های بزرگتری را بعد از UF تولید می کنند. قرار گیری یک پروتئین در معرض جریان هیدرودینامیک نیز می تواند باعث کاهش فعالیت مولکول شود (میرون، دوتورینه، تابت و پونچه، 2018).

 

2.4. رابطه بین برهمکنش های الکترواستاتیک و آبگریز پروتئین کشک و گرفتگی غشا

آبگریزی و بار سطحی دو خاصیت فیزیکی شیمیایی هستند که فهمیده شده تاثیر مهمی بر میزان جذب در سیستم های آبی، وارد می کنند. اینها مربوط به برهمکنش های متقابل جاذبه آبگریزی و دافعه الکترواساتیک می باشند (شیائو، وانگ، هوانگ، وایته و ون، 2011). چهار اثر اساسی بر گرفتگی غشا وجود دارند که شامل (الف) اثر آبگریزی غشا (ب) اثر بار سطحی غشا (ج) اثر آبگریزی پروتئین و (د) اثر بار سطحی پروتئین می باشند. جدا از بررسی جداگانه این اثرات، تعداد معدودی پژوهشگر به اثر ترکیبی برای نمونه (ب) و (د) یا (ج) و (د)، توجه داشته اند. با اصلاح سطوح غشاها براساس این درک، کاهش برهمکنش غشا پروتئین مضر، امکان پذیر است (مک دونوگ و چیمیل).

تعدادی از نویسندگان استدلال می کنند که پروتئین هایی که شدیدا در نقطه ایزوالکتریک خود آبگریز هستند و اینکه جذب سطحی آنها بر غشاها بنابراین می تواند بخاطر برهمکنش آبگریزی افزایش یابد. پروتئین های درون محلول ممکن است راحت تر در نقطه ایزوالکتریک خود تجمع کنند که این بخاطر کاهش دافعه الکترواستاتیک می باشند و این توده ها ممکن است باعث آلودن و گرفتگی شوند. دلیل دیگر این است که پروتئین ها در نقطه ایزوالکتریک خود اندازه کوچکتری نسبت به مقادیر دیگر pH دارند و بنابراین، آسانتر از غشا عبور می کنند (هویسمن، پرادونوس و هرناندز، 2000). رفتار فیلتراسیون غشای پروتئین به اثرات ترکیبی (1) برهمکنش الکترواساتیکی بین مولکولی بین پروتئین های مجاور درون رسوب تشکیل شده بر سطح بالایی پروتئین های باردار و غشاهای باردار و (2) تجمع پروتئین در محلول توده (بالک) بخاطر پدیده نمک گیری در غلظت نمک زیاد (پالیسک و زیدنی، 1994).

غشاها بوسیله اصلاح شیمیایی یک غشای سلولوزی با استفاده از فعال سازی اپی کلروهیردین تولید شده است و پس از آن بوسیله واکنش با لیگاندهایی که تقریاً طول یکسان اما کارکرد گروه انتهایی متفاوت دارند (یعنی،آبدوست، آبگریز، اسیدی و بازی) ، تولید شده است. غشای زویتریونی بسیار آبدوست بود و گرفتگی بسیار اندکی در کل دامنه شرایط بررسی شده در این آزمایشات داشت. لیسوزیم در pH=7 (pI~11)، شدیداً باردار مثبت بود درحالی که آلفا-لاکتالبومین بار منفی داشت (pI~4.7). نسبت بازیابی شار کمتر با آلفا-لاکتالبومین احتمالاً بخاطر برهمکنش الکترواستاتیک جاذبه ضعیف بین آلفا-لاکتالبومین دارای بار منفی و بار مثبت اندک بر غشای زویتریونی در pH 7 بود، اگرچه حتی تحت این شرایط، غشای زویتریونی عملکرد بسیار خوبی دارد (حدیدی و زیدنی، 2014).

تک تک مقاومت ها بوسیله چهار مدل مقاومت، شامل انسداد کامل، انسداد متوسط، انسداد استاندارد و فیلتراسیون کیک، ارزیابی شدند و مکانیزهای آلودگی غالب نیز با استفاده از شکل های خطی مدل های کلاسیک و همچنین مدل های ترکیبی در طی فیلتراسیون چربی زدای کشک بوسیله یک غشای سرامیکی TiO₂-بواهمیت مورد بررسی قرار گرفتند. کندترین فیلتراسیون در pH 4.0 (یعنی تقریباً در نقطه ایزوالکتریکی α-la، β-lg و BSA) رخ داد. علاوه بر آن، در pH=10.0، ته نشینی فسفات کلسیم و غیرطبیعی شدن پروتئین های کشک مسئول کاهش شار بودند. مدل «فیلتراسیون کیک» (CFM)، مناسب ترین مدل برای توصیف کاهش شار بود. شار نفوذپذیری برحسب زمان در pH 7.0 بیشتر بود، زیرا پروتئین ها بخوبی محلول و پایدار شدند بنابراین توده تشکیل نخواهند داد. یک مدل فیلتراسیون انسداد-کیک کامل، مکانیزم غالب بود. تمیز شدن غشاهای MF TiO₂-بوئهمیت با محلول قلیایی، بازیابی اکثر شار غشا را ممکن ساخت (گلبندی، عبدی، بابالو، خوش فترت و محمدلو، 2013).

بارهای استاتیک بین پروتئین و کارکرد پروتئین باعث تجمع و رسوب پروتئین بر سطح غشا شد. برهمکنش های الکترواستاتیکی بین پروتئین ها و غشا می توانند باعث چسبندگی پروتئین سطحی غشا شوند و بر تخلخل غشا تاثیر خواهند گذاشت و باعث انسداد تخلخل های غشا با کاهش شار غشا شد. برای محلولی که حاوی پروتئین های مختلف است، بازیابی همه پروتئین ها با استفاده از یک غشا دشوار است و این به طور قابل ملاحظه تنها عملکرد دافعه بار است. هر مولفه پروتئین بار متفاوتی در شرایط pH مختلف دارند و این باعث می شود که حفظ دافعه پروتئین-پروتئین و پروتئین-غشا برای فیلتراسیون دشوار شود.

 

3.4. اندازه و صورت بندی پروتئین برای برهمکنش های غشا و پروتئین

کاربرد مواد غشای مختلف و فرآیندهای عملکردی مختلف برای استحصال پروتئین کشک پنیر، بخاطر گرفتگی غشا جلوگیری شد و در نتیجه باعث کاهش شار نفوذپذیری و انتقال پروتئین با گذشت زمان شد (مارشال، مونرو و تراگاردث، 1993). با اینکه، مطالعات گسترده ای برای تعیین  مدل مکانیزمی آلودگی غشا صورت گرفته است، اما هنوز این مکانیزم ناشناخته باقی مانده است. گرفتگی غشا با عوامل بسیاری برای محدود کردن عملکرد غشا، بخصوص عملکرد درازمدت، که کنترل آن بسیار دشوار می باشد، بسیار پیچیده است. دفع و ترد براحتی افزایش می یابد هنگامی که جاذبه پروتئین، ضریب غربال موثر غشا را کاهش می دهد. همچنین شار سریعاً با افزایش دفع و ترد، کاهش می یابد. تاثیر pH و یون ها بر شار درازمدت بوسیله تغییرات صورت بندی و اثرات بار در مواد حل شده رسوب یافته برروی غشا، تبیین شده اند (ای. فین، فل، و واترز، 1983؛ سوکی، فین و فل، 1984). در ادبیات، تنزل شار در طی UF کشک شیرین در سه مرحله به این صورت توصیف شده است: (1) ایجاد یک لایه قطبش (2) گرفتگی غشا بخاطر جذب سطحی و (3) گرفتگی غشا بخاطر رسوب مواد. فهمیده شده که دفع پروتئین ها به نوع انسداد و به شرایط عملکردی بستگی دارند (ایمار، تادی، لافایله و سانچز، 1988؛ باون، کالوو و هرناندز، 1995؛ ای. فین و فل، 1987). علاوه بر آن، پژوهش های بسیاری نشان داده اند که ذرات کوچک آسانتر از ذرات بزرگ رسوب می کنند و در نتیجه باعث گرفتگی غشا می شوند. آلتمن و ریپرگر (1997) نشان دادند که نیروهای هیدرودینامیک، چسبندگی و اصطکاک وارد شده بر یک ذره در طی فرآیند میکروفیلتراسیون وجود دارند. تعادل بین نیروی لیفت و نیروی دراگ جریان محصول فیلتر عمدتاً تعیین کننده تشکیل لایه در غشا می باشند. هنگامی که اندازه ذره افزایش یافت، نیروی دراگ و نیروی لیفت بزرگتر از نیروهای چسبندگی و اصطکاک بودند. در این زمان، ذرات برروی غشا رسوب نکردند و وارد غلظت شدند. کاظمی و همکاران (2012) نیز دریافتند که ذره های بزرگتر به آسانی در راستای غشا در طی فرآیند فیلتراسیون آبجوی غیرالکلی، پاکسازی و رفته شدند. چن (2007)، مشخصات گرفتگی غشا در فیلتراسیون یک مخلوط پروتئین را گزارش داد. اجزاء بزرگ پروتئین محصول بزرگتری نسبت به اجزاء کوچک در فیلتراسیون کوتاه مدت تر 2 ساعت داشتند. اما، با افزایش مدت فیلتراسیون به مدت 6 ساعت، اجزاء بزرگ پروتئین، بازده یا محصول کمتری نسبت به اجزاء کوچک داشتند. نورازمان و همکاران (2013)، تمیزکاری شیمیایی غشاهای پلی اترسولفون (PES) آلوده شده در طی الترافیلتراسیون محلول محصول ایزولاسیون پروتئین کشک از طریق تحلیل اجزاء پروتئین باقیمانده برروی سطح غشا را بررسی کردند. ارزیابی Lowry و «الکتروفورز ژل» برای برآورد مقدار و ترکیب پروتئین برروی غشا قبل و بعد از تمیزکاری استفاده شدند. مولفه های وزن مولکولی زیاد در لایه آلوده کننده توانستند آسانتر از اجزاء کوچکتر زدوده شوند و پروتئین ها در تخلخل های غشایی که تمیزکاری در آنها دشوارتر بود، گیر افتادند. باربا و همکاران (2001)، نشان دادند که نه تنها پپتیدها بلکه همچنین دو پروتئین بومی (یعنی، بتا-لاکتوگلوبولین و آلفا-لاکتالبومین) در طی الترافیلتراسیون کشک تحلیل شده بوسیله HPLC،  عبور کردند و به مواد نفوذپذیری (permeate) تبدیل شدند. در طی فرآیند الترافیلتراسیون کشک، بنظر رسید که آلفا-لاکتالبومین باعث کاهش شار بیشتر و حداقل شدن آلبومین سرم گاوی شد. بعد از 10 دقیقه کار، بتا-لاکتوگلوبولین عامل عمده در گرفتگی و آلودن بود (مرین و همکاران، 1980؛ راماچاندار و رائو، 2002؛ تولکاچ و همکاران، 2006). فهمیده شد که توده های β-lg ، گرفتگی غشا را در طی MF و UF تسریع می بخشند که این بخاطر واکنش های کووالانسی تیول/دی سولفید بود. هنگامی که ساختارهای ثانویه و ثالث یک پروتئین باز شدند، گروه های آبگریز برهمکنش می کنند و پیوند آب را کاهش می دهند. چنین برهمکنش های آبگریز باعث توده سازی و پس از آن لخته شدن و رسوب می شوند (روسا، گویمارائس و آرسه، 2019). برای فیلتراسیون جریان عرضی کشک شیرین، گرفتگی غشا بوسیله توده های پروتئین کشک تا میزان معینی از غیرطبیعی سازی پروتئین کشک، شتاب گرفت. بالاتر از مقدار بحرانی غیرطبیعی سازی پروتئین 30%، شار مجدداً افزایش یافت. این اثر با بهبود فرسایش توده های پروتئین کشک بزرگتر و همچنین کاهش واکنش پذیری توده های پروتئین کشک پیر شده با حرارت (heat-aged)، توجیه می شوند (استینهاوئر، مارکس، بوگندورفر و کولوزیک، 2015).