ترجمه مقاله پزشکی روشی برای اندازه‌گیری آسیب DNA در سلول‌های منفرد
در این تحقیق روشی برای سنجش کامت ارائه می‌کنیم که مبتنی بر الکتروفورز است و می‌تواند برای اندازه‌گیری آسیب DNA در سلول‌های یوکاریوت کاربرد داشته باشد. این روش از نظر اجرایی تطبیق پذیر و نسبتاً ساده بوده و یک روش حساس محسوب می‌شود. اگرچه اغلب تحقیقات حاکی از توانایی این روش برای اندازه‌گیری شکست‌های تک‌رشته‌ای DNA است, اما ایجاد تغییراتی در این روش امکان شناسایی شکست‌های دو رشته‌ای DNA, پیوندهای تقاطعی، آسیب قلیایی و هسته‌های آپوپتوتیک را فراهم می‌کند. حد حساسیت این روش تقریباً برابر 50 رشته شکست در سلول‌های پستانداران دیپلوئیدی است. آسیب DNA و ترمیم آن در محلول‌های تک‌سلولی تهیه‌شده از مخمر, تک‌یاخته, گیاهان, بی‌مهرگان و پستانداران نیز می‌تواند با استفاده از این روش بررسی شود. در اصل این روش برای اندازه‌گیری تغییرات در میزان آسیب DNA و ظرفیت ترمیم در یک جمعیت از سلول‌های پستانداران استفاده می‌شود, اما در حال حاضر سنجش کامت برای پایش آسیب DNA در توالی‌های ژنومی خاص استفاده می‌شود. این پروتکل می‌تواند در کمتر از 24 ساعت تکمیل گردد.
مقدمه
توسعه روش
مفهوم الکتروفورز در اولین بار در سال ۱۹۸۴ توسط Ostling و Johanson به عنوان روشی برای رزیابی شکست تک رشته‌ای DNA که باعث بازرامش[1] مارپیچ‌های DNA می‌شود، معرفی شد. نسخه تغییر یافته این روش توسط Singh و همکاران در سال ۱۹۸۸ منتشر شد که از شرایط قلیایی استفاده کرد. این ایده ترکیب کردن ژل DNA با میکروسکوپ فلورسنس برای تجسم انتقال رشته‌های DNA از سلول‌های جاسازی شده روی آگارز[2] بود. اگر DNA بار منفی حاوی بشکند، مارپیچ‌های DNA آزاد شده و انتهای شکسته می‌تواند در طول یک الکتروفورز گذرا به سمت آند حرکت کند. اگر DNA آسیب‌ندیده باشد، فقدان اهداف آزاد و اندازه بزرگ قطعات مانع از انتقال آنها می‌شود. تعیین مقدار نسبی DNA که انتقال یافته روشی ساده برای اندازه‌گیری تعداد شکست DNA در یک سلول مجزا ارائه کرده‌است. اگرچه روش‌های نسبتاً حساسی برای تشخیص شکست تک رشته‌ایDNA در اواسط دهه ۱۹۷۰ معرفی شدند، سه واقعیت (علاوه بر جاذبه آشکار "مشاهده" DNA آسیب‌دیده) این روش را جذاب کرد. ابتدا، تنها حدود ۱۰۰۰ سلول مورد نیاز بود. دوم اینکه، این سلول‌ها نیازی به برچسب زدن با رادیوایزوتوپ نداشتند، در نتیجه امکان اندازه‌گیری آسیب در هر سلول هسته ای وجود دارد. شاید مهم‌تر از همه، این روش می‌تواند برای اندازه‌گیری تغییرات در واکنش به عوامل مخرب DNA بین سلول‌های دارای همان جمعیت مورد استفاده قرار گیرد.
در سال ۱۹۹۰، روش اصلی Ostling و Johanson اصلاح شد و پس از ظاهر شدن DNA از یک سلول منفرد، به "سنجش کامت" نامگذاری شد. سر کامت که حاوی DNA با وزن مولکولی بالا و دنباله کامت است، در زمان واقعی از تصاویر رقومی شده با استفاده از نرم‌افزار طراحی‌شده برای این هدف اندازه‌گیری شد. دنباله ممان، معیاری از مقدار و توزیع DNA در دنباله و یک معیار ارزیابی قوی از در امتداد طول دنباله و درصد DNA در دنباله است.
گروه تحقیقاتی سنجش کامت پیشنهادات موثر و اطلاعات مفیدی در مورد پروتکل‌های مختلف و سیستم‌های تحلیل تصویر و یک فروم برای بحث درباره مسایل مربوط به این روش حوزه ارایه می‌دهند (http://cometassay.com).
کاربردهای سنجش کامت
از زمان توسعه اولیه سنجش کامت، تلاش‌های متعددی برای بهبود حساسیت و قابلیت اعتماد این روش و گسترش کاربردهای آن در آنالیز انواع مختلف آسیب DNA در سلول‌های مختلف، افزایش ظرفیت نمونه‌برداری، ۱۱ را افزایش داده و استانداردسازی پروتکل‌ها و تجزیه و تحلیل انجام شده‌است. تلاش برای بهینه‌سازی غلظت آگاروز، تجزیه بافرها و لکه‌های DNA توسط گروه‌های متعدد انجام شد. یک نسخه از روشی که در شرایط خنثی انجام گرفت امکان تشخیص شکست دو رشته‌ای DNA را مستقل از وجود شکست تک رشته‌ای منفرد فراهم کرد. آسیب قلیایی می‌تواند با کشت سلول‌های تجزیه شده و تخریب شده با آسیب قلیایی قبل از الکتروفورز شناسایی شود. پیوندهای تقاطعی بین رشته‌ای را میتوان با شناسایی شکست‌های تک رشته‌ای که پیش از این شناخته شده بودند، شناسایی کرد. فراگمانتاسیون DNA گسترده که در سلول‌های آپوپتوتیک رخ می‌دهد این سلول‌ها را سادگی قابل شناسایی می‌کند.
توانایی سنجش ناهمگنی در پاسخ به عوامل مخرب DNA ابتدا بر روی سلول‌هایی که در معرض داروهای شیمی‌درمانی قرار داشتند, ارزیابی شد. طیف گسترده‌ای از روش‌های سنجش کامت نشان داد که برخی از هسته‌ها دارای تعداد زیادی شکست بودند در حالی که برخی دیگر آسیب‌ندیده بودند. اهمیت ناهمگنی در آسیب‌های DNA در توضیح مقاومت به درمان سرطان پس از آن در سلول‌هایی از مدل‌های تومور حیوانات و علایم بالینی مشاهده شد. پتانسیل پیش‌بینی پاسخ تومور به درمان‌های خاص که موجب آسیب DNA می‌شوند, در حال حاضر برای چندین بیمار سرطانی نشان‌داده شده‌است.
بخش عمده‌ای از توانایی روش از کاربردهای بالقوه آن در بیومونیتوری انسان و ارزیابی زیست‌محیطی موجودات زنده که در معرض آلودگی‌های محیطی هستند، ناشی می‌شود. کاربردهای جدید این روش شامل شناسایی دانه های جادویی[3] از مارکرهای سطح سلولی موجود در سلول‌هایی که در آگاروز و فلوروسانس در هیبریداسیون درجا برای تشخیص اثرات توالی - خاص در DNA آسیب‌دیده می‌شوند
تغییراتی که در روش برای سلول‌های پستانداران اعمال می‌شود
اگرچه چندین پروتکل برای آماده‌سازی اسلایدها، سلول‌های تجزیه شونده، شکل دادن اسلایدها با الکتروفورز و آغشتگی اسلایدها وجود دارد، نتایج بسیار قابل توجهی برای سلول های پستانداران با استفاده از بیشتر روش های ارائه شده مشابه به دست آمده است. مهم‌ترین تفاوت‌های این روش‌ها عبارتند از طول انکوباسیون در محلول قلیایی و نمک، و اینکه مرحله تجزیه مواد زدایا پیش از مرحله دگرگونی قلیایی است.. در اینجا ما یک دوره تجزیه را برای حساسیت و تکرارپذیری بهینه در نظر می‌گیریم، اما مزایای زیادی برای تکمیل پروتکل در زمان کوتاه‌تر وجود دارد. همانند همه تکنیک‌ها، توجه دقیق به جزییات فنی، تکرارپذیری سنجش را بهبود خواهد بخشید. برای بیومونیتوری ، مزایای مهمی برای استاندارد کردن پروتکل‌های سنجش کامت و روش‌های آنالیز وجود دارد. تاکنون اجرای بهتر رشو کامت و دستیابی به اهداف مروبطه، کارگاه‌ها و کارگروه‌های مختلفی تشکیل شده‌اند. ملاحظات مربوط به روش‌های آماری مختلف نیز در این مراجع در دسترس قرار گرفته است.
نتایج اندازه‌گیری‌های مختلف آسیب DNA با سنجش کمت معمولاً دارای توزیع نرمال نیست. به طور معمول، مقادیر متوسط یا میانه برای ۲۵ تا ۱۰۰ کامت همراه با مقادیر صدک ۷۵ ام که به عنوان یک باکس پلات نشان داده می‌شود، می‌تواند به صورت مکفی بیشتر مجموعه‌های داده را توصیف کند. نمودارهای دو بعدی درصد DNA در دنباله در مقابل میزان DNA نیز برای ارزیابی نقش چرخه سلولی و یا پلویید در آسیب DNA مفید هستند. هنگامی که هدف اندازه‌گیری ناهمگونی در میزان آسیب DNA درون یک جمعیت باشد، کامت‌های بیشتری مورد تحلیل قرار می‌گیرند و روش‌های آنالیز داده‌ها نیز باید مورد استفاده قرار گیرند. بحث در مورد اینکه کدام کامت به بهترین شکل ممکن است نتایج را توصیف کند ادامه پیئت می‌کند. درصد DNA در دنباله، طول دنباله (در سطح آسیب پایین) و ممان دنباله، که درصد DNA در دنباله است که در فاصله بین میانگین توزیع سر و دنباله ضرب می‌شود، معیارهای مفیدی هستند.
دو تغییر در پروتکل کامت در ادامه شرح‌داده شده‌است. اولین مورد را میتوان برای تشخیص ترکیب شکست تک رشته‌ای و شکست دو رشته‌ای DNA و جایگاه‌های ناپایدار قلیایی در DNA استفاده کرد. اگرچه مدت‌زمان طولانی تجزیه برای ایجاد زمان کافی برای بازشدن DNA واسرشته [4] از نقاط شکست توصیه می‌شود, زمان تجزیه کوتاه‌تر برای اهداف غربالگری کافی است. اگرچه در اینجا توضیح داده نشده است, تغییرات در این روش نیز می‌تواند برای شناسایی پیوندهای متقاطع و آسیب قلیایی DNA استفاده شود.
شکل ۱ روابط واکنش دوز معمول برای سلول‌های انسانی که در معرض تابش یونیزاسیون با استفاده از دو روش شرح‌داده‌شده در این پروتکل است. (a، b) سلول‌های لنفوبلاست انسان با استفاده از روش قلیایی شبانه مورد بررسی قرار گرفتند که شکست‌های تک رشته‌ای DNA، شکست دو رشته‌ای DNA و نقاط ناپایداری قلیایی را شناسایی می‌کند. (c، d) سلول‌های کارسینوما رحم انسان با استفاده از روش تجزیه خنثی مورد بررسی قرار گرفتند که شکست دو رشته‌ای را شناسایی می‌کند. محلول‌های تک‌سلولی در معرض اشعه ایکس روی یخ برای مهار اتصال رشته قرار گرفتند. نشان‌داده شده‌است که در a و c از کنترل‌های (چپ)، بعد از ۲ یا ۳۰ Gy (خاکستری، میانی)، و بعد از ۸ یا ۶۰ Gy (راست) نشان‌داده شده‌است. نمودارها در b و d منحنی‌های واکنش دوز معمولی (میانگین ± میانگین) را نشان می‌دهند. د. (n = ۳). توجه داشته باشید که تفاوت ۴۰ برابر در شیب‌های دو منحنی پاسخ دوز، که با تفاوت در القا اختلالات تک رشته‌ای در مقابل قطع دوگانه توسط تابش یونیزه شده سازگار است. نمایی از تصاویر میکروسکوپی روش سنجش کامت برای سه دوز نشان‌داده شده‌است، و قطعات دو متغیره محتوای DNA در مقابل دنباله دنباله داری، واکنش سلول‌های مجزا در فازه‌ای مختلف چرخه سلول را نشان می‌دهد (a، c). اگرچه DNA فاز S شکل شامل تعداد مشابهی از شکست‌های یگانه و دوگانه تحت کنترل دالتون است، تحت شرایط واسرشته- و در نتیجه DNA فازی سریع‌تر از DNA از سلول‌ها در مرحله G۱ یا G۲ انتقال می‌یابد. نقطه مقابل با استفاده از روش خنثی رخ می‌دهد زیرا حباب‌های تکرار شونده در سلول‌های S - شکل، انتقال DNA را در حین با الکتروفورز را به تعویق می‌اندازد.
روش دوم تحت شرایط خنثی انجام می‌شود و تنها شکست دو رشته‌ای DNA را شناسایی می‌کند. این امر را می توان با قرار دادن سلول ها در معرض پراکسید هیدروژن انجام داد که باعث افزایش 1000 برابری و یا بیشتر شکست‌های تک رشته ای نسبت به شکست‌های دو رشته‌ای حتی در غلظت های میلی مولار می شود. باید تاکید شود که اجرای آزمایش کامت تحت شرایط غیر واسرشته، اندازه‌گیری شکست DNA دو رشته‌ای DNA را تضمین نمی‌کند. در حقیقت روش Ostling و Johanson از تجزیه خنثی استفاده کردند، اما محققین به طور واضح تصور می‌کردند که کاهش مارپیچ‌های DNA ناشی از شکست‌های تک رشته‌ای DNA جلوگیری کرده‌اند. از آنجا که حدود ۲۰۰۰ شکست برای بازرامش تمام مارپیچ‌های کافی است، این روش به تشخیص شکست تک رشته‌ای در سطوح آسیب پایین‌تر محدود شده‌است. نسخه روش شرح‌داده‌شده در اینجا تحت شرایط خنثی می‌تواند برای اندازه‌گیری طول شکست‌های دو رشته‌ای در محدوده حدود ۵۰ تا ۱۰۰۰۰ شکست در هر سلول استفاده شود.
محدودیت‌های روش
توانایی تجزیه و تحلیل سلول‌های مجزا یک مزیت در شناسایی گروه‌های جمعیتی است که به طور متفاوت نسبت به ترمیم سیتوتوکسیک واکنش نشان می‌دهند. با این حال، محدودیت‌های عملی برای تعداد سلول‌ها و نمونه‌ها وجود دارد که میتوان آنها را آنالیز کرد. در بهترین حالت ۶۰۰ کامت در هر ساعت را میتوان به صورت جداگانه مورد بررسی قرار داد و به ترتیب ۵۰ اسلاید در روز را میتوان با استفاده از سیستم‌های خودکار به ثمر رساند. همانطور که قبلاً اشاره شد، اندازه نمونه پیشنهادی ۵۰ کامت ممکن است کافی نباشد اگر ناهمگونی قابل‌توجهی در آسیب DNA درون یک جمعیت وجود داشته باشد.
دومین محدودیت, نیاز به یک سوسپانسیون سلولی قابل دوام است. اگر نمونه‌ها شامل سلول‌های نکروتیک و یا آپوپتوتیک باشند, اطلاعات دقیق در مورد وجود نقاط خاص مانند قطع رشته یا آسیب قلیایی را نمیتوان به دست آورد. روش‌های پراکنده‌سازی بافت باید برای به حداقل رساندن هر گونه آسیب DNA تولید شده توسط روش, توسعه داده شوند. اگر به اندازه کافی سریع عمل شود, روش‌های تجزیه مکانیکی (بریدن و فیلتر کردن) می‌تواند مورد استفاده قرار گیرد. اما این احتمال که ممکن است از دست دادن ترجیحی سلول‌های آسیب‌دیده در طول آماده‌سازی سلول منفرد باشد, باید در نظر گرفته شود.
سنجش کامت هیچ اطلاعاتی در مورد اندازه قطعه DNA ایجاد نمی‌کند چون قطعات در طول مدت کوتاه الکتروفورز از هم جدا نمی‌شوند. در عوض، همانطور که تعداد شکست DNA افزایش می‌یابد، حلقه‌های مارپیچ آرام می‌شوند، انتهای آزاد بیشتر قادر به انتقال هستند، و در نتیجه بخش بزرگتری از DNA از سر کامت فاصله می‌گیرد. برخی از اطلاعات را میتوان از طریق اندازه‌گیری توزیع آسیب DNA درون دنباله کامت به دست آورد، اما برآورد دقیق اندازه قطعه نیاز به استفاده از روش‌هایی مانند الکتروفورز ژل فیلد پالس دارد.
سلول‌ها به طور فعال تکرار رفتار DNA خود را در طی الکتروفورز ژل تغییر می‌دهند و این می‌تواند با تفاوت در حساسیت ذاتی اشتباه گرفته شود. تحت شرایط قلیایی، چنگال تکثیر[5] به عنوان شکست تک رشته‌ای عمل می‌کند به طوری که DNA فاز S با سرعت بیشتری انتقال می‌کند. در شرایط خنثی، DNA فاز S به عنوان حباب‌های تکرار عمل می‌کند که انتقال را در طول الکتروفورز به تعویق می‌اندازد. این مشکل به راحتی در شکل ۱ دیده می‌شود. اما با این که سنجش کامت می‌تواند اندازه DNA و آسیب DNA را اندازه‌گیری کند، امکان تجزیه و تحلیل آسیب‌ها در هر فاز از چرخه سلولی وجود دارد.
تفسیر نتایج کامت با توجه این واقعیت که هیچ رابطه ساده‌ای بین میزان آسیب DNA ناشی از یک ماده شیمیایی خاص و اثرات بیولوژیکی آن وجود ندارد، بسیار پیچیده است. هر دارویی می‌تواند برحسب تعداد وقفه‌های DNA که با یک سیستم زیستی خاص مرتبط است, متفاوت باشد. مواد شیمیایی که پیوندهای متقاطع را تولید می‌کنند, تشخیص تک رشته‌ای را با مشکل خواهند کرد. به همین دلیل, تجزیه و تحلیل اثرات ترکیب داروها و یا دارویی با دو مکانیسم مختلف تولید آسیب DNA می‌تواند مشکل‌ساز باشد. مقایسه نتایج حاصل از آزمون کامت با دیگر اقدامات مربوط به آسیب DNA (مضاعف, میکرونوکلئوس, جهش, سطوح اضافی, ناهنجاری‌های کروموزومی و کشتار سلولی) برای تفسیر ارتباط بیولوژیکی آسیب ضروری است. لازم به ذکر است که آسیب DNA اندازه‌گیری شده در سنجش کامت لزوماً یک نتیجه مستقیم نیست; آسیب غشایی یا میتوکندریایی می‌تواند سبب جدایش DNA از طریق آپوپتوز و یا نکروز شود.
بسیاری از محققان به بررسی ظرفیت ترمیم DNA سلول‌ها با اندازه‌گیری کاهش آسیب به عنوان تابعی از زمان پس از مواجهه با یک عامل ژنوتوکسیک شناخته‌شده علاقه‌مند هستند. اگر عامل به سرعت تزریق شود (برای مثال، اشعه ایکس) و یا تحت شرایطی که از ترمیم جلوگیری می‌کند (4 درجه سانتی‌گراد), نیمه عمر بازیابی می‌تواند با قرار دادن سلول‌های ترمیم شده تحت شرایطی که امکان ترمیم را فراهم می‌کند تعیین شود (رشد متوسط کامل در 37 درجه سانتی‌گراد). با این حال, فرآیندهای ترمیم اغلب می‌تواند ارزیابی DNA را پیچیده کند. برای مواجهه با زمان‌های طولانی, آسیب DNA معیاری از القاء و ترمیم است. به طور مشابه, پیوندهای متقاطع ناشی از سیس پلاتین به چندین ساعت نیاز دارند تا هر دو مقدار آسیب و بازده ترمیم به آسیب‌های کلی شناسایی‌شده کمک کنند. برای بعضی عوامل (به عنوان مثال اشعه ماوراء بنفش C و N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine)، آسیب اندازه گیری شده با استفاده از روش سنجش کامت می تواند منجر به برش در نقاط آسیب قلیایی تولید شده در حین ترمیم مجدد نوکلئوتید شود. در این شرایط, " خسارت " به یک معیار برای ترمیم تبدیل می‌شود. در نهایت ترمیم برخی از انواع آسیب‌های DNA در موجودات زنده مشکل است. شکست ناشی از پرتوهای یونیزان و برخی انواع آسیب‌های قلیایی توسط گونه‌های فعال اکسیژن را میتوان در نصف زمان، کمتر از 30 دقیقه و در مدت‌زمان کوتاهی جبران کرد.
